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ag亚游集团平台:一例猪蓝耳病的实验室诊断及NSP2、ORF5基因序列分析

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  猪亦称猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪繁殖障碍和呼吸道传染病,临床主要表现为妊娠繁殖障碍,妊娠母猪流产、弱胎、死胎、木乃伊胎;主要表现为间质性肺炎等症状。本病于20世纪80年代在美国首次流行以来,迅速传遍世界主要国家,中国于1995年发现该病,是威胁我国当前太阳城业持续健康发展的主要疫病之一,加强该病的分析研究和综合防控,对生产稳定发展意义重大。2016年12月,四川眉山某暴发疑似猪繁殖与呼吸综合征疫情,发病猪呼吸困难,剖检肺部病变明显,送至四川农业大学动物生物技术中心进行实验室检测。

  1材料与方法

  1.1 临床样品采集

  2016年12月,四川眉山某猪场发生疑似PRRS,主要表现为仔猪食欲减退、高热,体温41 ℃,轻微腹泻以及严重的呼吸道症状,剖检可见肺部间质性肺炎,全身淋巴结轻度。通过临床特征和病理解剖初步判断为PRRS。采集发病猪血清以及肺脏、淋巴结和脾脏等组织冷藏保存,送实验室进行PRRSV的RT-PCR诊断。

  1.2 主要仪器和材料

  Mastercycler PCR 扩增仪(Eppendorf,德国)、Gel Doc 2000 凝胶图像分析系统(BIO-RAD,美国)、2×Taq Plus PCR MasterMix(含染料)购自天根生化科技(北京)有限公司,反转录试剂盒、TakaRaTaqDNA酶和DL 2 000 DNA Marker(宝生物工程大连有限公司)。

  1.3 引物设计与合成

  本实验所使用引物如表1所示,所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

  1.4 病料处理及RNA的抽提

  取采集病料0.5~2.0 g 研磨,并按1∶3 比例加入生理盐水配成病料悬液,随后反复冻融3次。冻融后按12 000 r/min 离心5 min 后取上清液,按照Trizol法提取RNA,并将提取的RNA按照反转录试剂盒方法制成cDNA保存备用。

  1.5 RT-PCR检测

  取1μL cDNA于PCR管中,然后分别加入引物P1、P2和P3各10 pmol,2×PCR Master Mix 25μL,并补加无菌水至50μL,混匀后置PCR仪中按照以下程序进行扩增:95 ℃,1min;95℃,5s,57℃ 10 s,72 ℃ 10 s,40个循环;72 ℃ 1 min; PCR结束后取5μL进行琼脂糖凝胶电泳检测目的条带。

  1.6 Nsp2和ORF5基因扩增

  以1.5反转录的cDNA为模板,分别加入Nsp2-1、Nsp2-2引物和ORF5-1、ORF5-2引物,2×PCR Master Mix 25μL,并补加无菌水至50μL,扩增Nsp2高变区和ORF5基因。

  1.7 克隆与鉴定

  PCR扩增结束后用1%琼脂糖凝胶电泳、电压100 V、30~50 min后观察结果,按照胶回收试剂盒说明书回收目的基因片段,与pMD19-T Simple Vector载体连接,转化DH5α感受态细胞,挑取白色菌落,接种于LB液体培养基(Amp+)中培养后提取质粒,经NcoI、BamH I双酶切及PCR鉴定,阳性菌液保存备用。

  1.8 序列测定及分析

  将含目的DNA的阳性菌液送至宝生物工程(大连)有限公司进行测序。采用DNAStar软件(Version 7.0)对Nsp2基因、ORF5基因序列与GenBank中收录的PRRSV的Nsp2基因、ORF5 基因序列的核苷酸及氨基酸序列进行同源性分析,应用ClustalX、Mega 4.1 软件绘制进化树。

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